النسخ العكسي (إنزيم الانعكاس أو بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي الريبي) هو إنزيم يحفز تخليق DNA على قالب RNA في عملية تسمى " النسخ العكسي". يعكس اسم العملية عكس العملية النسخفي الاتجاه الآخر: يتم تصنيع نسخة RNA من جزيء قالب DNA.
تم عزل هذه الإنزيمات من فيروسات RNA ( الفيروسات القهقرية). يتم استخدام النسخ العكسي بواسطة فيروسات الورم لنسخ mRNA إلى خيط تكميلي من الحمض النووي. عند دراسة الفيروسات القهقرية ، التي يتم تمثيل جينومها بجزيئات الحمض النووي الريبي أحادية الشريطة ، وجد أنه في عملية التطور داخل الخلايا ، يمر الفيروس القهقري بمرحلة دمج جينومه في شكل DNA مزدوج الشريطة في كروموسومات الخلية المضيفة. في عام 1964 ، طرح Temin فرضية حول وجود إنزيم خاص بالفيروس قادر على تصنيع الحمض النووي التكميلي في قالب RNA. تكللت الجهود الرامية إلى عزل مثل هذا الإنزيم بالنجاح ، وفي عام 1970 اكتشف Temin و Mizutani ، وكذلك بالتيمور بشكل مستقل عنهما ، الإنزيم المطلوب في تحضير فيروسات فيروس ساركوما روس خارج الخلية. يُطلق على بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي الريبي هذا اسم النسخ العكسي أو التراجع.
تمت دراسة الإنزيم المرتجع لفيروسات الطيور القهقرية بأكبر قدر من التفصيل. تحتوي كل فيريون على حوالي 50 جزيءًا من هذا الإنزيم. يتكون النسخ العكسي من وحدتين فرعيتين ، أ (65 كيلو دالتون) وب (95 كيلو دالتون) ، موجودان بكميات متساوية المولي. يحتوي إنزيم النسخ العكسي على ثلاثة أنشطة إنزيمية على الأقل:
1) بوليميريز الحمض النووي ، باستخدام كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي كقالب ؛
2) نشاط RNase H ، الذي يحلل الحمض النووي الريبي كجزء من هجين RNA-DNA ؛
3) نشاط نوكلياز الحمض النووي.
النشاطان الأولان مطلوبان لتخليق الحمض النووي الفيروسي ، ويبدو أن نوكلياز داخلي مهم لدمج الحمض النووي الفيروسي في جينوم الخلية المضيفة. يقوم إنزيم النسخ العكسي المنقى بتوليف الحمض النووي في كل من قوالب الحمض النووي الريبي والحمض النووي (الشكل 11).
أرز. 11. مخطط لتوليف نسخ الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل من جزيئات الحمض النووي الريبي
لبدء التوليف ، يحتاج الانزيم العكسي ، مثل البوليميرات الأخرى ، إلى منطقة قصيرة مزدوجة الشريطة (التمهيدي). يمكن أن يكون التمهيدي عبارة عن قطعة أحادية الجديلة من كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي ، والتي تصبح أثناء التفاعل مرتبطة تساهميًا بشريط الحمض النووي المركب حديثًا. في الهندسة الوراثية ، يتم استخدام كل من البادئات oligo- (dT) المكملة لنهايات 3'-polyA من الرنا المرسال ومجموعة من hexanucleotides "العشوائية" في التركيب والتسلسل (بادئات عشوائية). غالبًا لجزيئات RNA ذات التسلسل الأولي المعروف الذي لا تحتوي على نهايات 3'- بولي (A) ، استخدم أليغنوكليوتيد مركب كيميائيًا مكملًا للطرف 3 بوصات
يستخدم النسخ العكسي في الغالب لنسخ الحمض النووي الريبي المرسال إلى الحمض النووي التكميلي (كدنا). يتم إجراء تفاعل النسخ العكسي في ظل ظروف محددة باستخدام مثبطات قوية لنشاط RNase. في هذه الحالة ، من الممكن الحصول على نسخ DNA كاملة الطول من جزيئات الحمض النووي الريبي المستهدفة. بعد التوليف على mRNA لشريط الحمض النووي التكميلي وتدمير الحمض النووي الريبي (عادةً ما يتم استخدام المعالجة القلوية) ، يتم إجراء توليف خيط DNA الثاني. في هذه الحالة ، يتم استخدام قدرة الإنزيم العكسي على تكوين دبابيس شعر مكملة ذاتيًا في الأطراف الثلاثة للـ cDNA أحادي الجديلة ، والتي يمكن أن تكون بمثابة مادة أولية.
القالب هو أول خيط من [كدنا]. يمكن تحفيز هذا التفاعل بواسطة كل من إنزيم الانعكاس و E.coli DNA polymerase I. لقد ثبت أن الجمع بين هذين الإنزيمين يجعل من الممكن زيادة إنتاج جزيئات (كدنا) مزدوجة الشريطة الكاملة. عند الانتهاء من التوليف ، تظل الخيوط الأولى والثانية من (كدنا) مرتبطة تساهميًا بواسطة حلقة دبوس الشعر ، والتي كانت بمثابة مادة أولية في تركيب الخيط الثاني. هذه الحلقة مشقوقة مع نوكلياز S1 ، الذي يدمر على وجه التحديد المناطق المفردة من الأحماض النووية. لا تكون النهايات الناتجة غير حادة دائمًا ، ولزيادة كفاءة الاستنساخ اللاحق ، يتم إصلاحها لتقلل باستخدام جزء Klenow من E.coli DNA polymerase I. يمكن بعد ذلك إدخال cDNA مزدوج الشريطة الناتج في نواقل الاستنساخ ، ونشره كجزيئات DNA هجينة ، واستخدامه لمزيد من البحث.
Revertase هو إنزيم يصنع cDNA على قالب RNA.
في بعض الفيروسات ، لا يكون الجينوم DNA ، كالعادة ، بل هو RNA. كانت تسمى هذه الفيروسات بالفيروسات القهقرية (رجعية - عكسية). في عام 1970 ، اكتشف D. Baltimore و H.M. Temin آلية لنقل المعلومات من الحمض النووي الريبي الفيروسي إلى الحمض النووي ، أي على عكس ما يحدث في خلايا الكائنات الحية العليا. تسمى هذه العملية النسخ العكسي ، ويسمى الإنزيم الذي ينفذها بالنسخ العكسي أو التراجع.
النسخ العكسي ، أو التراجع (النسخ العكسي ، [lat. النسخ- إعادة الكتابة) - إنزيم بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي الريبي ، والذي يتم إجراء النسخ العكسي له - تخليق الحمض النووي على قالب الحمض النووي الريبي ؛ المشفرة بواسطة جينومات بعض الفيروسات المحتوية على الحمض النووي الريبي والعناصر الوراثية المتنقلة لجينوم الكائنات الحية الأعلى ، وهي "أداة" مهمة للهندسة الوراثية. يحتوي إنزيم النسخ العكسي على ثلاثة أنشطة إنزيمية على الأقل:
1) بوليميريز الحمض النووي ، باستخدام كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي كقالب ؛
2) نشاط RNase H ، الذي يحلل الحمض النووي الريبي في هجين RNA-DNA ، ولكن ليس RNA أحادي أو مزدوج الشريطة ، و
3) نشاط نوكلياز الحمض النووي.
تم اكتشافه بشكل مستقل من قبل D.
وبالتالي ، فإن النسخ العكسية قادرة على تصنيع الحمض النووي على قالب الحمض النووي الريبي عن طريق بلمرة أربعة فوسفات ديوكسي ريبونوكليوزيد. ومثلها مثل بوليميرات الحمض النووي ، فإنها تعمل فقط في وجود البذرة.
تُستخدم النسخ العكسية في تخليق الحمض النووي المزدوج الشريطة المكمّل للحمض النووي الريبي (خاصةً الرنا المرسال) لاستنساخه اللاحق في نواقل البلازميد للحصول على مكتبات [كدنا] (كلونوتيك). يمكن استخدام النسخ العكسية ، مثل بوليميراز الحمض النووي ، لإدخال ملصق مشع أو فلوري في تحقيقات الحمض النووي في ثلاثي فوسفات deoxyribonucleoside المسمى بشكل مناسب.
تم إثبات القدرة على تصنيع الحمض النووي من قالب الحمض النووي الريبي في ظل ظروف معينة من أجل بوليميراز DNA Thermus thermophilus. يسمح ذلك باستخدامه للكشف المباشر عن رنا محدد في العينات البيولوجية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. تجعل التعديلات الحديثة لهذا النهج من الممكن في خليط تفاعل واحد (وأنبوب اختبار) تجميع عدد صغير من نسخ جزء الحمض النووي المضخم على قالب RNA في تفاعل النسخ العكسي ، والتي يتم استخدامها على الفور بواسطة نفس الإنزيم كقالب في PCR التقليدي (أنبوب واحد PCR).
عند دراسة الفيروسات القهقرية ، التي يتم تمثيل جينومها بجزيئات الحمض النووي الريبي أحادية الشريطة ، وجد أنها تمر بمرحلة تكامل الجينوم الخاص بها في شكل DNA مزدوج الشريطة في كروموسومات المضيف. خلية - زنزانة. في عام 1964 ، طرح X. Temin فرضية حول وجود إنزيم خاص بالفيروس قادر على تصنيع الحمض النووي التكميلي في قالب RNA. في عام 1970 ، اكتشف X. Temin و S.Mizutani ، وكذلك بشكل مستقل D. Baltimore ، مثل هذا الإنزيم في تحضير فيروسات فيروس ساركوما روس خارج الخلية. يُطلق على بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي الريبي هذا اسم النسخ العكسي (النسخ العكسي).
تمت دراسة الإنزيم المرتجع لفيروسات الطيور القهقرية بأكبر قدر من التفصيل. تحتوي كل فيريون على حوالي 50 جزيءًا من هذا الإنزيم. يتكون النسخ العكسي من وحدتين فرعيتين - ά (65 كيلو دالتون) و β (95 كيلو دالتون) ، موجودان بكميات متساوية. الوحدة الفرعية ά هي الجزء N- الطرفي (ثلثا) الوحدة الفرعية β.
يحتوي إنزيم النسخ العكسي على ثلاثة أنشطة إنزيمية على الأقل:
بوليميريز DNA ، باستخدام كل من RNA و DNA كقالب ؛
نشاط RNase H ، الذي يحلل الحمض النووي الريبي في هجين RNA-DNA ، ولكن ليس RNA أحادي أو مزدوج الشريطة ؛
نوكلياز الحمض النووي.
النشاطان الأولان مطلوبان لتخليق الحمض النووي الفيروسي ، ويبدو أن نوكلياز داخلي مهم لدمج الحمض النووي الفيروسي في جينوم الخلية المضيفة. تحتوي الوحدة الفرعية β للإنزيم العكسي على جميع الأنشطة الثلاثة ، بينما تحتوي الوحدة الفرعية على بوليميريز و RNase H.
يقوم إنزيم النسخ العكسي المنقى بتوليف الحمض النووي في كل من قوالب الحمض النووي الريبي والحمض النووي. لبدء التوليف ، يحتاج الانزيم العكسي ، مثل البوليميرات الأخرى ، إلى منطقة قصيرة مزدوجة الشريطة - مادة أولية. يمكن أن يكون التمهيدي عبارة عن قطعة أحادية الجديلة من كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي ، والتي تصبح أثناء التفاعل مرتبطة تساهميًا بشريط الحمض النووي المركب حديثًا.
يستخدم النسخ العكسي في الغالب لنسخ الحمض النووي الريبي المرسال إلى الحمض النووي التكميلي (كدنا). يتم إجراء تفاعل النسخ العكسي في وجود مثبطات قوية لنشاط RNase. في هذه الحالة ، من الممكن الحصول على نسخ DNA كاملة الطول من جزيئات الحمض النووي الريبي المستهدفة. يستخدم Oligo (dT) كأساس للنسخ العكسي لبولي (A) الذي يحتوي على mRNA (الشكل) ، ولجزيئات الحمض النووي الريبي التي لا تحتوي على نهايات 3 "بولي (A) ، قليل النوكليوتيدات المركبة كيميائيًا مكملة للنهاية 3 بوصات درس الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحويل النوع الأخير من جزيئات الحمض النووي الريبي إلى جزيئات تحتوي على بولي (A) باستخدام E. coli poly (A) polymerase.
بعد التوليف على mRNA لشريط الحمض النووي التكميلي وتدمير الحمض النووي الريبي (عادةً ما يتم استخدام المعالجة القلوية) ، يتم إجراء توليف خيط DNA الثاني. في هذه الحالة ، يتم استخدام قدرة الإنزيم العكسي على تكوين دبابيس شعر مكملة ذاتيًا عند الأطراف الثلاثة للـ cDNA أحادي الجديلة ، والتي يمكن أن تكون بمثابة مادة أولية. ويعمل الشريط الأول من cDNA كقالب. ويمكن تحفيز هذا التفاعل بواسطة كل من إنزيم الانزيم المعكوس و E.coli DNA polymerase I. يسمح الجمع بين هذين الإنزيمين بزيادة إنتاج جزيئات cDNA مزدوجة الشريطة كاملة.
عند الانتهاء من التوليف ، تظل الخيوط الأولى والثانية من (كدنا) مرتبطة تساهميًا بواسطة حلقة دبوس الشعر ، والتي كانت بمثابة مادة أولية في تركيب الخيط الثاني. هذه الحلقة مشقوقة مع نوكلياز S1 ، الذي يدمر على وجه التحديد المناطق المفردة من الأحماض النووية. لا تكون النهايات الناتجة غير حادة دائمًا ، ولزيادة كفاءة الاستنساخ اللاحق ، يتم إصلاحها لتقلل باستخدام جزء Klenow من E.coli DNA polymerase I. يمكن بعد ذلك إدخال cDNA مزدوج الشريطة الناتج في نواقل الاستنساخ ، ونشره كجزيئات DNA هجينة ، واستخدامه لمزيد من البحث.
النسخ العكسي (إنزيم الانعكاس أو بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي الريبي) هو إنزيم يحفز تخليق DNA على قالب RNA في عملية تسمى " النسخ العكسي". يعكس اسم العملية عكس العملية النسخفي الاتجاه الآخر: يتم تصنيع نسخة RNA من جزيء قالب DNA.
تم عزل هذه الإنزيمات من فيروسات RNA ( الفيروسات القهقرية). يتم استخدام النسخ العكسي بواسطة فيروسات الورم لنسخ mRNA إلى خيط تكميلي من الحمض النووي. عند دراسة الفيروسات القهقرية ، التي يتم تمثيل جينومها بجزيئات الحمض النووي الريبي أحادية الشريطة ، وجد أنه في عملية التطور داخل الخلايا ، يمر الفيروس القهقري بمرحلة دمج جينومه في شكل DNA مزدوج الشريطة في كروموسومات الخلية المضيفة. في عام 1964 ، طرح Temin فرضية حول وجود إنزيم خاص بالفيروس قادر على تصنيع الحمض النووي التكميلي في قالب RNA. تكللت الجهود الرامية إلى عزل مثل هذا الإنزيم بالنجاح ، وفي عام 1970 اكتشف Temin و Mizutani ، وكذلك بالتيمور بشكل مستقل عنهما ، الإنزيم المطلوب في تحضير فيروسات فيروس ساركوما روس خارج الخلية. يُطلق على بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي الريبي هذا اسم النسخ العكسي أو التراجع.
تمت دراسة الإنزيم المرتجع لفيروسات الطيور القهقرية بأكبر قدر من التفصيل. تحتوي كل فيريون على حوالي 50 جزيءًا من هذا الإنزيم. يتكون النسخ العكسي من وحدتين فرعيتين ، أ (65 كيلو دالتون) وب (95 كيلو دالتون) ، موجودان بكميات متساوية المولي. يحتوي إنزيم النسخ العكسي على ثلاثة أنشطة إنزيمية على الأقل:
1) بوليميريز الحمض النووي ، باستخدام كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي كقالب ؛
2) نشاط RNase H ، الذي يحلل الحمض النووي الريبي كجزء من هجين RNA-DNA ؛
3) نشاط نوكلياز الحمض النووي.
النشاطان الأولان مطلوبان لتخليق الحمض النووي الفيروسي ، ويبدو أن نوكلياز داخلي مهم لدمج الحمض النووي الفيروسي في جينوم الخلية المضيفة. يقوم إنزيم النسخ العكسي المنقى بتوليف الحمض النووي في كل من قوالب الحمض النووي الريبي والحمض النووي (الشكل 11).
أرز. 11. مخطط لتوليف نسخ الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل من جزيئات الحمض النووي الريبي
لبدء التوليف ، يحتاج الانزيم العكسي ، مثل البوليميرات الأخرى ، إلى منطقة قصيرة مزدوجة الشريطة (التمهيدي). يمكن أن يكون التمهيدي عبارة عن قطعة أحادية الجديلة من كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي ، والتي تصبح أثناء التفاعل مرتبطة تساهميًا بشريط الحمض النووي المركب حديثًا. في الهندسة الوراثية ، يتم استخدام كل من البادئات oligo- (dT) المكملة لنهايات 3'-polyA من الرنا المرسال ومجموعة من hexanucleotides "العشوائية" في التركيب والتسلسل (بادئات عشوائية). غالبًا لجزيئات RNA ذات التسلسل الأولي المعروف الذي لا تحتوي على نهايات 3'- بولي (A) ، استخدم أليغنوكليوتيد مركب كيميائيًا مكملًا للطرف 3 بوصات
يستخدم النسخ العكسي في الغالب لنسخ الحمض النووي الريبي المرسال إلى الحمض النووي التكميلي (كدنا). يتم إجراء تفاعل النسخ العكسي في ظل ظروف محددة باستخدام مثبطات قوية لنشاط RNase. في هذه الحالة ، من الممكن الحصول على نسخ DNA كاملة الطول من جزيئات الحمض النووي الريبي المستهدفة. بعد التوليف على mRNA لشريط الحمض النووي التكميلي وتدمير الحمض النووي الريبي (عادةً ما يتم استخدام المعالجة القلوية) ، يتم إجراء توليف خيط DNA الثاني. في هذه الحالة ، يتم استخدام قدرة الإنزيم العكسي على تكوين دبابيس شعر مكملة ذاتيًا في الأطراف الثلاثة للـ cDNA أحادي الجديلة ، والتي يمكن أن تكون بمثابة مادة أولية.
القالب هو أول خيط من [كدنا]. يمكن تحفيز هذا التفاعل بواسطة كل من إنزيم الانعكاس و E.coli DNA polymerase I. لقد ثبت أن الجمع بين هذين الإنزيمين يجعل من الممكن زيادة إنتاج جزيئات (كدنا) مزدوجة الشريطة الكاملة. عند الانتهاء من التوليف ، تظل الخيوط الأولى والثانية من (كدنا) مرتبطة تساهميًا بواسطة حلقة دبوس الشعر ، والتي كانت بمثابة مادة أولية في تركيب الخيط الثاني. هذه الحلقة مشقوقة مع نوكلياز S1 ، الذي يدمر على وجه التحديد المناطق المفردة من الأحماض النووية. لا تكون النهايات الناتجة غير حادة دائمًا ، ولزيادة كفاءة الاستنساخ اللاحق ، يتم إصلاحها لتقلل باستخدام جزء Klenow من E.coli DNA polymerase I. يمكن بعد ذلك إدخال cDNA مزدوج الشريطة الناتج في نواقل الاستنساخ ، ونشره كجزيئات DNA هجينة ، واستخدامه لمزيد من البحث.