Reverzna transkriptaza (revertaza). Reverzna transkriptaza Kateri postopek uporablja encim reverzno transkriptazo

19.08.2020

Reverzna transkriptaza (reverznaza ali RNA-odvisna DNA polimeraza) je encim, ki katalizira sintezo DNK na RNA predlogi v procesu, imenovanem " povratna transkripcija". Ime procesa odraža nasprotje procesa transkripcije izvedemo v drugi smeri: iz molekule DNK predloge se sintetizira transkript RNA.

Ti encimi so bili izolirani iz virusov RNA ( retrovirusi). Reverzno transkriptazo uporabljajo tumorski virusi za prepisovanje mRNA v komplementarno verigo DNK. Pri proučevanju retrovirusov, katerih genom predstavljajo enoverižne molekule RNA, je bilo ugotovljeno, da gre retrovirus v procesu znotrajceličnega razvoja skozi stopnjo integracije svojega genoma v obliki dvoverižne DNK v kromosome gostiteljsko celico. Leta 1964 je Temin postavil hipotezo o obstoju virusno specifičnega encima, ki je sposoben sintetizirati komplementarno DNK na RNA predlogi. Prizadevanja za izolacijo takega encima so bila kronana z uspehom in leta 1970 sta Temin in Mizutani, pa tudi Baltimore neodvisno od njih, odkrila želeni encim v pripravku virionov zunajceličnega virusa Rousovega sarkoma. Ta RNA-odvisna DNA polimeraza se imenuje reverzna transkriptaza ali revertaza.

Revertaza ptičjih retrovirusov je bila najbolj podrobno raziskana. Vsak virion vsebuje približno 50 molekul tega encima. Reverzna transkriptaza je sestavljena iz dveh podenot - a (65 kDa) in b (95 kDa), prisotni v ekvimolarnih količinah. Reverzna transkriptaza ima vsaj tri encimske aktivnosti:

1) DNK polimeraza z uporabo tako RNA kot DNK kot predloge;

2) aktivnost RNaze H, ki hidrolizira RNA kot del RNA-DNA hibrida;

3) aktivnost DNA endonukleaze.

Prvi dve aktivnosti sta potrebni za sintezo virusne DNK in zdi se, da je endonukleaza pomembna za integracijo virusne DNK v genom gostiteljske celice. Prečiščena reverzna transkriptaza sintetizira DNK na RNA in DNK predlogah (slika 11).

riž. 11. Shema za sintezo dvoverižnih DNA kopij molekul RNA

Za začetek sinteze reverzetaza, tako kot druge polimeraze, potrebuje kratko dvoverižno regijo (primer). Primer je lahko enoverižni segment tako RNA kot DNK, ki se med reakcijo kovalentno vežeta na novo sintetizirano verigo DNK. V genskem inženiringu se uporabljata oba oligo-(dT) primerja, ki komplementarna koncem 3'-poliA mRNA, in nabor heksanukleotidov, »naključnih« po sestavi in zaporedju (naključni primerji). Pogosto za molekule RNA z znanim primarnim zaporedjem, ki nimajo 3'-poli (A) koncev, uporabite kemično sintetizirane oligonukleotide, komplementarne 3" koncu

Reverzna transkriptaza se pretežno uporablja za prepis sporočilne RNA v komplementarno DNK (cDNA). Reakcija reverzne transkripcije poteka pod posebej izbranimi pogoji z uporabo močnih zaviralcev aktivnosti RNaze. V tem primeru je mogoče dobiti kopije DNK v polni dolžini ciljnih molekul RNA. Po sintezi na mRNA komplementarne verige DNK in uničenju RNA (običajno se uporablja alkalna obdelava) se izvede sinteza druge verige DNK. V tem primeru se uporablja sposobnost reversetaze, da tvori samokomplementarne lasnice na 3' koncih enoverižne cDNA, ki lahko deluje kot temeljni premaz.

Predloga je prva veriga cDNA. To reakcijo lahko katalizirata tako reverznata kot E. coli DNA polimeraza I. Pokazalo se je, da kombinacija teh dveh encimov omogoča povečanje donosa popolnih dvoverižnih molekul cDNA. Po zaključku sinteze ostaneta prva in druga veriga cDNA kovalentno povezana z zanko za lasišče, ki je služila kot temelj pri sintezi druge verige. Ta zanka je razcepljena z endonukleazo S1, ki specifično uniči enoverižne regije nukleinskih kislin. Nastali konci niso vedno topi in za povečanje učinkovitosti kasnejšega kloniranja jih popravimo tako, da so topi z uporabo Klenowovega fragmenta E. coli DNA polimeraze I. Nastalo dvoverižno cDNA lahko nato vstavimo v vektorje za kloniranje, razmnožimo kot hibridne molekule DNK in uporabimo za nadaljnje raziskave.

Revertaza je encim, ki sintetizira cDNA na RNA predlogi.

Pri nekaterih virusih genom ni DNK, kot običajno, ampak RNA. Takšne viruse so imenovali retrovirusi (retro - reverse). Leta 1970 sta D. Baltimore in H. M. Temin odkrila mehanizem za prenos informacij iz virusne RNA v DNK, t.j. nasprotno od tistega, kar se dogaja v celicah višjih organizmov. Ta proces se imenuje reverzna transkripcija, encim, ki ga izvaja, pa reverzna transkriptaza ali revertaza.

Reverzna transkriptaza ali revertaza (reverzna transkriptaza, [lat. transkripcija- prepisovanje) - encim RNA-odvisna DNA polimeraza, s pomočjo katere se izvaja povratna transkripcija - sinteza DNK na RNA predlogi; kodirani z genomi nekaterih virusov, ki vsebujejo RNA, in mobilnimi genetskimi elementi genoma višjih organizmov, pomembno »orodje« za genski inženiring. Reverzna transkriptaza ima vsaj tri encimske aktivnosti:

1) DNK polimeraza z uporabo tako RNA kot DNK kot predloge;

2) aktivnost RNaze H, ki hidrolizira RNA v hibridu RNA-DNA, ne pa eno- ali dvoverižne RNA, in

3) aktivnost DNA endonukleaze.

Neodvisno odkrila D. Baltimore in H. Temin leta 1970 v tumorskih virusih, ki vsebujejo RNA (Nobelova nagrada za 1975, skupaj z R. Dulbecco).

Tako so reverzne transkriptaze sposobne sintetizirati DNK na RNA predlogi s polimerizacijo štirih deoksiribonukleozid trifosfatov. In tako kot DNK polimeraze delujejo le v prisotnosti semena.

Reverzne transkriptaze se uporabljajo pri sintezi dvoverižne DNK, komplementarne RNA (zlasti mRNA) za njeno kasnejše kloniranje v plazmidnih vektorjih, da dobimo knjižnice cDNA (klonoteke). Reverzne transkriptaze, kot so DNA polimeraze, se lahko uporabijo za uvedbo radioaktivne ali fluorescentne oznake v DNK sonde v ustrezno označenih deoksiribonukleozidnih trifosfatih.

Sposobnost sinteze DNK iz RNA predloge pod določenimi pogoji je bila dokazana za termostabilno DNK polimerazo Thermus thermophilus. To omogoča, da se uporablja za neposredno odkrivanje specifičnih RNA v bioloških vzorcih s PCR. Sodobne modifikacije tega pristopa omogočajo v eni reakcijski mešanici (in epruveti) sintetizirati v reakciji reverzne transkripcije majhno število kopij pomnoženega fragmenta DNA na RNA predlogi, ki jih isti encim takoj uporabi kot predlogo. v običajnem PCR (PCR z eno epruveto).

Pri proučevanju retrovirusov, katerih genom predstavljajo enoverižne molekule RNA, je bilo ugotovljeno, da v procesu znotrajceličnega razvoja preidejo skozi fazo integracije svojega genoma v obliki dvoverižne DNK v kromosome gostitelja. celica. Leta 1964 je X. Temin postavil hipotezo o obstoju virusno specifičnega encima, ki je sposoben sintetizirati komplementarno DNK na RNA predlogi. Leta 1970 sta X. Temin in S. Mizutani ter neodvisno D. Baltimore odkrila tak encim v pripravku virionov zunajceličnega virusa Rousovega sarkoma. Ta RNA-odvisna DNA polimeraza se imenuje reverzna transkriptaza (reverzna transkriptaza).

Revertaza ptičjih retrovirusov je bila najbolj podrobno raziskana. Vsak virion vsebuje približno 50 molekul tega encima. Reverzna transkriptaza je sestavljena iz dveh podenot, ά (65 kDa) in β (95 kDa), prisotnih v ekvimolarnih količinah. ά-podenota je N-terminalni del (dve tretjini) β-podenote.

Reverzna transkriptaza ima vsaj tri encimske aktivnosti:

DNA polimeraza z uporabo tako RNA kot DNK kot predloge;

aktivnost RNaze H, ki hidrolizira RNA v hibridu RNA-DNA, ne pa eno- ali dvoverižne RNA;

DNA endonukleaza.

Prvi dve aktivnosti sta potrebni za sintezo virusne DNK in zdi se, da je endonukleaza pomembna za integracijo virusne DNK v genom gostiteljske celice. β-podenota reversetaze ima vse tri aktivnosti, medtem ko ima ά-podenota samo polimerazo in RNazo H.

Prečiščena reverzna transkriptaza sintetizira DNK na predlogah RNA in DNK. Za začetek sinteze reversetaza, tako kot druge polimeraze, potrebuje kratko dvoverižno regijo - temeljni premaz. Primer je lahko enoverižni segment tako RNA kot DNK, ki se med reakcijo kovalentno vežeta na novo sintetizirano verigo DNK.

Reverzna transkriptaza se pretežno uporablja za prepis sporočilne RNA v komplementarno DNK (cDNA). Reakcija reverzne transkripcije poteka v prisotnosti močnih zaviralcev aktivnosti RNAze. V tem primeru je mogoče dobiti kopije DNK v polni dolžini ciljnih molekul RNA. Oligo(dT) se uporablja kot primer za reverzno transkripcijo mRNA, ki vsebuje poli(A) (slika), in za molekule RNA, ki nimajo 3" poli(A) koncev, kemično sintetizirane oligonukleotide, komplementarne 3" koncu preučevali RNA. Poleg tega lahko slednjo vrsto molekul RNA pretvorimo v molekule, ki vsebujejo poli(A) z uporabo poli(A) polimeraze E. coli.

Po sintezi na mRNA komplementarne verige DNK in uničenju RNA (običajno se uporablja alkalna obdelava) se sintetizira druga veriga DNK. V tem primeru se uporablja sposobnost reversetaze, da tvori samokomplementarne lasnice na 3 "koncih enoverižne cDNA, ki lahko deluje kot temeljni element. Prva veriga cDNA služi kot šablona. To reakcijo je mogoče katalizirati tako reversetazo kot E. coli DNA polimerazo I. Kombinacija teh dveh encimov omogoča povečanje donosa polnopravnih dvoverižnih molekul cDNA.

Po zaključku sinteze ostaneta prva in druga veriga cDNA kovalentno povezana z zanko za lasišče, ki je služila kot temelj pri sintezi druge verige. Ta zanka je razcepljena z endonukleazo S1, ki specifično uniči enoverižne regije nukleinskih kislin. Nastali konci niso vedno topi in za povečanje učinkovitosti kasnejšega kloniranja jih popravimo tako, da so topi z uporabo Klenowovega fragmenta E. coli DNA polimeraze I. Nastalo dvoverižno cDNA lahko nato vstavimo v vektorje za kloniranje, razmnožimo kot hibridne molekule DNK in uporabimo za nadaljnje raziskave.

1) DNK polimeraza z uporabo tako RNA kot DNK kot predloge;

2) aktivnost RNaze H, ki hidrolizira RNA kot del RNA-DNA hibrida;

3) aktivnost DNA endonukleaze.

riž. 11. Shema za sintezo dvoverižnih DNA kopij molekul RNA